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1、 血清的主要成分和功能

牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中對細(xì)胞的生長增殖具有重要甚至是難以替代的作用，它含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成分。主要有以下成分和功能：

A、 血清中的主要物質(zhì)—蛋白質(zhì)如白蛋白等具有緩沖細(xì)胞培養(yǎng)液酸堿度、維持滲透壓的作用。

B、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白等結(jié)合蛋白，有識別維生素、脂類、金屬和其它激素等，并能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，從而起到解毒作用。

C、 纖維粘連素、胎牛血清中的胎球蛋白、貼壁因子等能促進(jìn)細(xì)胞貼壁、鋪展。

D、 多肽類如血小板促生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、神經(jīng)細(xì)胞生長因子、胰島素、類胰島素生長因子、促生長激素等能支持細(xì)胞分裂增殖并維持細(xì)胞對數(shù)生長。

E、 2巨球蛋白等蛋白酶抑制劑能抑制蛋白酶，保護(hù)細(xì)胞不受損害。

F、 血清中還含有豐富的氨基酸、葡萄糖、酮酸及與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素等，對細(xì)胞培養(yǎng)均有意義。

正因?yàn)檠寰哂腥绱藦?fù)雜的成分和重要的功能，所以血清的保存和使用顯得非常重要。

2、 保存血清的方法：

我們建議血清應(yīng)保存在-15℃至-20℃，有效期為5年，若存放于4℃時(shí)，請勿超過四周，若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。不宜反復(fù)凍融。配制成*培養(yǎng)基后應(yīng)在四周內(nèi)用完。

3、 血清解凍后有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后也會(huì)存在于血清中，也是造成沉淀物的主要原因之一，但這些絮狀沉淀物并不影響血清本身的質(zhì)量，若您欲除去這些沉淀，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以直接過濾的方式去除這些沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過濾膜。

4、 如何解凍血清才不會(huì)使血清質(zhì)量受損：

我們建議您將血清從冷藏箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融，但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

5、 為什么要熱滅活血清：

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦您使用熱滅活血清。

6、 有必要做熱滅活嗎：

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)細(xì)胞而言是不需要的，經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱滅活處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，類似于“小黑點(diǎn)”形狀，這常常會(huì)讓研究者誤認(rèn)為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱滅活處理，如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量！

7、 如何避免沉淀物的產(chǎn)生：

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列操作：

A、 解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫），若血清解凍時(shí)改變的溫度太大（如-20℃至37℃），實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

B、 解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

C、 請勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，從而影響血清質(zhì)量。

D、 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可無須做此步驟，若必須做血清的熱滅活，請嚴(yán)格遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

ELISA檢測樣品的處理方法

通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準(zhǔn)確性的*步，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。

1、  血清

血清是zui常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。

用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標(biāo)本，將試管或離心管室溫放置2小時(shí)或4℃GUOYE，使血清析出。（將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃ 1000×g離心20分鐘，仔細(xì)收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

采血過程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標(biāo)記的ELISA檢測中會(huì)有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準(zhǔn)確性。同時(shí)也應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。

2、  血漿

用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標(biāo)本，標(biāo)本采集后30min內(nèi)4℃ 1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標(biāo)本。

常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時(shí)還應(yīng)仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

3、  細(xì)胞培養(yǎng)上清

取細(xì)胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

4、  細(xì)胞裂解液

1）  吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。

2）  收集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。

3）  加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。

4）  將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。

5）  4℃ 10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

5、組織勻漿液

1）  將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。

2）  將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分

3）  將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，檢測后計(jì)算樣品濃度時(shí)應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）

4）  吸取勻漿液到離心管，4℃ 5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

6、  尿液、唾液等其他液體生物樣本

1000×g離心20min，取上清即可檢測。

總的來說，因?yàn)镋LISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。

為了保證檢測的準(zhǔn)確性，保存于-20℃或-80℃的樣本在1~6個(gè)月內(nèi)檢測；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測。

另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因?yàn)镹aN3會(huì)抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。