細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)小黑點(diǎn)是什么原因 如何解決？

在細(xì)胞培養(yǎng)中常可見到細(xì)胞及培養(yǎng)液中有一些大小不等、形態(tài)不同的黑色未知顆粒，去網(wǎng)上查詢得到的答案也多種多樣。

那么這些小黑點(diǎn)究竟是什么？我們又該怎么去應(yīng)對這種情況？

細(xì)胞碎片類

在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候， 由于細(xì)胞代謝、物質(zhì)交換、周邊環(huán)境變化，尤其是在從37度培養(yǎng)箱中拿出來觀察的過程中，由于液體培養(yǎng)基的比熱較大，液內(nèi)溫度高于外界溫度，造成冷熱交換、小范圍內(nèi)形成液體流動加劇，當(dāng)然這些小碎末就會被攪動起來形成似乎“游動"的感覺；隨著細(xì)胞培養(yǎng)的繼續(xù)，部分細(xì)胞開始衰亡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂，破裂之后的細(xì)胞內(nèi)容物泄露到培養(yǎng)液中。尤其是溶酶體的破壞，連續(xù)性地造成其他細(xì)胞和細(xì)胞器的損傷，如果換液不很勤，又會出現(xiàn)進(jìn)一步破壞和殘?jiān)某霈F(xiàn)；

再者，“小黑點(diǎn)"問題是很多細(xì)胞培養(yǎng)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的問題，但到目前為止尚未找到其監(jiān)測和排除的試劑和手段，這首先是由于所謂“小黑點(diǎn)"病原體根本難以收集和捕捉， 這也從另一個(gè)側(cè)面證明了“小黑點(diǎn)"問題的難以確定性；再說任何一種外來的微生物在培養(yǎng)基中都會有生命活動的反應(yīng)和表現(xiàn)，而不是簡單地運(yùn)動那樣的外觀性表現(xiàn)。

舉一個(gè)例子：如果“小黑點(diǎn)"的運(yùn)動狀況已經(jīng)到了用顯微鏡已經(jīng)可以觀察出的程度，其營養(yǎng)代謝和能量需求也就可想而知。這樣，培養(yǎng)液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發(fā)生明顯變化。

比如說：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，細(xì)胞大量破碎死亡、引發(fā)其它類型微生物侵染等等。而這些狀況，在所謂的“小黑點(diǎn)"感染中，是很難觀察到的。同時(shí)“小黑點(diǎn)"的出現(xiàn)而影響細(xì)胞狀態(tài)似乎得不到有力的證據(jù)。倒是細(xì)胞狀態(tài)下降的時(shí)候，“小黑點(diǎn)"明顯增多了。很有可能是細(xì)胞狀態(tài)下降時(shí)，細(xì)胞衰亡產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。所以小黑點(diǎn)屬于細(xì)胞碎片是比較可能和合理的。

玻璃培養(yǎng)瓶中的類似氧化硅的東西

網(wǎng)上有一篇文章說，小黑點(diǎn)其實(shí)不是一種生物，是無機(jī)物，其本質(zhì)是玻璃培養(yǎng)瓶里的硅顆粒。可影響細(xì)胞生長，細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)，不明顯。細(xì)胞狀態(tài)較差，數(shù)量少時(shí)才容易看到，好的辦法是用一次性培養(yǎng)瓶，可消除小黑點(diǎn)影響。

支原體

有人曾認(rèn)為小黑點(diǎn)可能是支原體污染，小黑點(diǎn)可以通過濾膜，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實(shí)驗(yàn)室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實(shí)驗(yàn)證明小黑點(diǎn)不會是支原體，原因如下：

1、光鏡下可見, 因?yàn)轶w積不對，支原體在普通顯微鏡下不能看到。

2、多種染色后可見，甚至hoechst即能將它染色,一般來說支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。所以，小黑點(diǎn)是一種支原體的可能性比較小。

真菌

有很多人發(fā)現(xiàn)類似小黑點(diǎn)的，但最后確定是真菌，二性霉素B對其有效。那說明小黑點(diǎn)不存在只是細(xì)胞培養(yǎng)中的真菌感染，還是說明小黑點(diǎn)屬于真菌類污染物。如果小黑點(diǎn)是一種真菌，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關(guān)注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認(rèn)為“小黑點(diǎn)"是真菌的細(xì)胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細(xì)胞被感染了，要進(jìn)行拯救處理，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，所以小黑點(diǎn)是一種真菌也是不太可能。

寄生類原蟲

小黑點(diǎn)屬于寄生類的原蟲，而不是細(xì)菌、支原體，也不是什么補(bǔ)體、細(xì)胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到它有兩種不同形態(tài)，一種較大，運(yùn)動較慢，泛紅光；另一種較小，運(yùn)動較快，紅中帶綠，個(gè)小的圍著個(gè)大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細(xì)胞就不能存活，也有人做過這樣的試驗(yàn)，單純培養(yǎng)過污染小黑點(diǎn)的血清4周，直到滿視野都是黑煤渣般的小黑點(diǎn)。給人的感覺是小黑點(diǎn)和細(xì)胞一樣有叢集性，如果密度低則生長緩慢，如果手懶，拖了幾天沒換液，待生長到一定濃度后便會飛速分生，細(xì)胞受感染的程度也大，這時(shí)除了培養(yǎng)基中可見外，細(xì)胞表面通常也象長滿了粉刺，所以有人認(rèn)為細(xì)胞旁分泌的某些因子可以抑制小黑點(diǎn)的生長。

據(jù)說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由于課題經(jīng)費(fèi)不夠而不能繼續(xù)進(jìn)行下去，所以并沒有明確的證據(jù)證明此項(xiàng)猜測的正確性。

那么如果您在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，可采取下列步驟：

首先，要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁，

然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動。

如果細(xì)胞被污染，微生物則會大量繁殖，培養(yǎng)基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：

(1)細(xì)胞生長過老，破碎的細(xì)胞殘骸;

(2)血清質(zhì)量不好，反復(fù)凍融的結(jié)果;

(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長;

(4)配制培養(yǎng)基的水質(zhì)、容器不合格。可應(yīng)用離心、過濾的方法去除這些黑點(diǎn);

(5)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。

以上就是小黑點(diǎn)會出現(xiàn)的可能原因，建議您購買HAKATA血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，達(dá)到理想的細(xì)胞培養(yǎng)效果。