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        細胞復(fù)蘇的步驟及注意事項

        2022-10-17 瀏覽次數(shù):1621

        一、主要步驟
        ①將冷凍管從液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,細胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細胞死亡率,復(fù)蘇過程中一般細胞死亡率在20%~25%之間。
        ②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒,然后放置在冰浴上。
        ③小心開啟瓶蓋,把細胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱,36℃~38℃培養(yǎng)1h,讓細胞貼壁。
        ④細胞貼壁后,小心移棄培養(yǎng)基,主要是去掉DMSO(懸浮生長細胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細胞及其碎片,加5mL新鮮培養(yǎng)基,36℃~38℃培養(yǎng)。
        ⑤細胞培養(yǎng)24h后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層,便可以傳代。
        ⑥詳細記錄復(fù)蘇細胞的名稱、數(shù)量、復(fù)蘇時間、存放部位等。

        二、注意事項
        1、注意無菌操作。
        2、應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)溫速度太慢,則會造成細胞損傷。另外,細胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進行,以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。
        3、細胞復(fù)蘇過程中,升溫的速率要大,把從液氮或-70℃冰箱中取出的細胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
        4、細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動,使其受熱均勻,并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br/>5、液氮操作有一定的危險性,打開液氮罐取出細胞時,戴上防護眼鏡。
        6、如果凍存管密封不嚴(yán),液氮可被吸入。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,將可能發(fā)生爆炸。復(fù)蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋。

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