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蒂科生物2018春季血清* WB標準protocol

2018-03-21 瀏覽次數：1381

蒂科生物2018春季血清* WB標準protocol

蒂科生物2018春季血清*，成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：

1凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析

2吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析

3處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上

4處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測

蒂科生物2018春季血清*，成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：

l 陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率

l 陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性

l 二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性

l 內參對照：檢測標本的質量和二抗系統

l 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果

蒂科生物2018春季血清*，WB檢測基本過程

1、獲取細胞或組織裂解物

1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：

蛋白位置	推薦buffer
全細胞	NP-40 or RIPA
胞漿（可溶性蛋白）	Tris-HCl
胞漿（骨架結合蛋白）	Tris-Triton
膜蛋白	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取試劑盒
線粒體蛋白	RIPA or 線粒體分離試劑盒

亦可購買商業化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量

2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay,Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白

3、電泳分離蛋白質

蒂科生物2018春季血清*，根據待測蛋白狀態確定電泳條件：

待測蛋白狀態	凝膠條件	上樣buffer	電泳buffer
Reduced - Denatured	還原，變性	含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Reduced - Native	還原，不變性	含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS
Oxidized - Denatured	不還原，變性	不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Oxidized - Native	不還原，不變性	不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS

根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度

蛋白分子量（kDa）	凝膠濃度（％）
4-40	20
12-45	15
10-70	12.5
15-100	10
25-200	8

4、轉膜

根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性，選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龍膜
靈敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	較高
蛋白結合能力	100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
機械強度	強	干的膜易脆	軟而結實
溶劑抗性	強	差	差
使用前是否需要浸潤	100%甲醛潤濕	緩沖液潤濕	緩沖液潤濕
適用染色方法	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁	不能用陰離子染料
適用檢測方法	顯色法、化學發光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測	顯色法、化學發光、熒光、放射性	顯色、化學發光、放射性
適用范圍	普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測	普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白	低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用
價格	高	較低	低

5、封閉

去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6、一抗孵育

一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：

l 選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）

l 選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）

l 選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用：

l 根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。

l 抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周

l 根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。

l 孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區別

7、二抗孵育

根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時

8、底物孵育

選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量

9、結果分析和檢測

凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片

Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進行洗滌，3次，每次5min

蒂科生物2018春季血清*，WB技術要點和常見問題分析

WB過程中常見的問題及可能原因分析

問題	可能原因	驗證或解決辦法
轉膜不充分	膜沒有*均勻濕透	使用100% methanol浸透膜
	靶蛋白分子量小于10,000	選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間
	靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液pH值	可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液
	甲醇濃度過高	過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
	轉移時間不夠Thick gel	對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間
背景高	膜沒有*均勻濕透	使用100% methanol浸透膜
	洗膜不充分	增加洗液體積和洗滌次數
	阻斷不充分	增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）
	二抗濃度過高	降低二抗濃度
	檢測過程中膜干燥	保證充分的反應液，避免出現干膜現象
	曝光過度	縮短曝光時間
	抗體與阻斷蛋白有交叉反應	檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應
沒有陽性條帶	抗體染色不充分	增加抗體濃度，延長孵育時間
	酶失活	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
	標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。
	試劑不匹配	一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性
	一抗失效	選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液
	HRP抑制劑	所用溶液和容器中避免含有疊N化Na
有陽性條帶，但條帶比較弱	抗體染色不充分	增加抗體濃度，延長孵育時間
	酶活性降低	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
	標本中靶蛋白含量太低	增加標本上樣量。
	洗膜過度	縮短洗滌時間
	HRP抑制劑	所用溶液和容器中避免含有疊N化Na
	抗體活性降低	選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置
	蛋白轉移不充分	見上述
	封閉過度	減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型
	曝光時間過短	延長曝光時間
	HRP抑制劑	所用溶液和容器中避免含有疊N化Na
條帶位置（大?。┎粚?；或有非特異性條帶	二抗的非特異性結合	增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）
	一抗的特異性不夠	使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性
	蛋白降解	使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑
	二聚體或多聚體存在	增加蛋白質變性過程及強度
	抗體濃度過高	降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶
	蛋白上樣量過大	降低上樣量
背景有斑點	封閉劑中有聚集體	使用前過濾封閉試劑
背景有斑點	HRP耦聯二抗中有聚集體	過濾二抗試劑，去除聚集體
膜上出現反像（暗背景上白色帶）	HRP含量過高	降低酶聯二抗的濃度