1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

       2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細(xì)胞，稀釋多余的培養(yǎng)基，之后吸走洗液，動作要輕，不可吹打到細(xì)胞。

       3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限。

       4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，細(xì)胞變圓，比較松動后，立即終止消化。

       5.加入該細(xì)胞對應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。

       6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時應(yīng)盡量以zui少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度、次數(shù)，還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細(xì)胞，又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長。

       7.依據(jù)傳代比例，將細(xì)胞懸液分瓶，再補充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng)，直止貼壁。

        貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對細(xì)胞進行傳代擴增。對于貼壁不太緊的細(xì)胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經(jīng)驗，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對于經(jīng)驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的。

        胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度則對細(xì)胞的活性影響較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復(fù)凍融、解凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強很多，不同細(xì)胞對消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞，該細(xì)胞消化時間可長達10分鐘左右。 消化時間仔細(xì)去摸索一下，每過2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄*消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。

        對于懸浮細(xì)胞換液時只需要補液就行。

        懸浮細(xì)胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過計數(shù)算好傳代的比例，直接分瓶，補液。有些懸浮細(xì)胞趨于成團生長，此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好，當(dāng)補液時，避免吹打。典型實例：jurkat就是成團生長。當(dāng)jurkat細(xì)胞密度比較大時，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右，待大部分細(xì)胞沉下，吸走上層清液，補充等量的新鮮培養(yǎng)基。而HL-60就不一樣了，為懸浮單個生長，如果發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞包團，說明細(xì)胞狀態(tài)不好，不加以正確的處理，zui終會發(fā)生凋亡
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