A4/Fuk細胞 A4/Fuk細胞株的凍存與復蘇

A4/Fuk細胞 A4/Fuk細胞株的凍存與復蘇

產品名稱：A-375細胞

中文名稱：彌漫大B細胞淋巴瘤細胞

規       格:1~3*106細胞/25cm2培養瓶

為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，*的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。
一、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：
包含10％甘油的*培養基，
包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養基，
50％ 細胞條件培養基和50％含有10％甘油的新鮮培養基，或
50％ 細胞條件培養基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養基。
對于無血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：
50％ 細胞條件無血清培養基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基，或
包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。
1、懸浮細胞
計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。
以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×1027在無血清培養基中，再次懸浮細胞。
分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。
2、貼壁細胞
使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到zui小。
在*生長培養基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。
以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。
以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。
分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。
二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入*生長培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然后加入*生長培養基中。
1、直接鋪板方法
取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
直接用*生長培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養基。進行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。培養細胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養基，去除凍存劑。
2、離心方法
取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養基，輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘。
棄去上清。
在*生長培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數。
細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。